DNA-Sequenzierungsverfahren

Techniken zur Sequenzierung von DNA

Das Gebiet der Biotechnologie ist eines der ständigen Veränderungen. Das schnelle Wachstum und die Entwicklung von Spitzenforschung hängen von der Innovation und Kreativität der Wissenschaftler und ihrer Fähigkeit ab, das Potenzial in einer grundlegenden molekularen Technik zu sehen und auf neue Prozesse anzuwenden. Das Aufkommen der PCR eröffnete viele Türen in der genetischen Forschung, einschließlich der DNA-Analyse und der Identifizierung verschiedener Gene auf der Grundlage ihrer DNA-Sequenzen.

DNA-Sequenzierung

In den späten 70er Jahren wurden zwei DNA-Sequenzierungsverfahren für längere DNA-Moleküle erfunden. Dies waren die

Sanger (oder Didesoxy) -Methode und die Maxam-Gilbert (chemische Spaltung) -Methode. Die Maxam-Gilbert-Methode basiert auf der nukleotidspezifischen Spaltung durch Chemikalien und wird am besten zur Sequenzierung von Oligonukleotiden (kurze Nukleotidpolymere, üblicherweise kleiner als 50 Basenpaare) verwendet. Die Sanger-Methode wird häufiger verwendet, weil sie sich nachweislich einfacher anzuwenden ist und mit dem Aufkommen der PCR und der Automatisierung der Technik leicht auf lange DNA-Stränge einschließlich einiger vollständiger Gene angewendet werden kann. Diese Technik basiert auf der Kettenbeendigung durch Didesoxynucleotide während PCR-Verlängerungsreaktionen.

Sanger-Methode

Bei der Sanger-Methode wird der zu analysierende DNA-Strang als Template verwendet und die DNA-Polymerase wird in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von Primern komplementäre Stränge erzeugen.

Es werden vier verschiedene PCR-Reaktionsgemische hergestellt, die jeweils einen bestimmten Prozentsatz an Didesoxynucleosidtriphosphat (ddNTP) -Analoga zu einem der vier Nucleotide (ATP, CTP, GTP oder TTP) enthalten. Die Synthese des neuen DNA-Stranges wird fortgesetzt, bis eines dieser Analoga inkorporiert ist, zu welchem ​​Zeitpunkt der Strang vorzeitig verkürzt ist.

Jede PCR-Reaktion enthält schließlich eine Mischung verschiedener Längen von DNA-Strängen, die alle mit dem Nucleotid enden, das für diese Reaktion Didesoxy-markiert war. Die Gelelektrophorese wird dann verwendet, um die Stränge der vier Reaktionen in vier getrennten Bahnen zu trennen und die Sequenz der ursprünglichen Matrize basierend darauf zu bestimmen, welche Längen von Strängen mit welchem ​​Nucleotid enden.

In der automatisierten Sanger-Reaktion werden Primer verwendet, die mit vier verschiedenfarbigen fluoreszierenden Tags markiert sind. PCR-Reaktionen in Gegenwart der verschiedenen Dideoxynukleotide werden wie oben beschrieben durchgeführt. Als nächstes werden die vier Reaktionsgemische jedoch vereinigt und auf eine einzelne Bahn eines Gels aufgetragen. Die Farbe jedes Fragments wird unter Verwendung eines Laserstrahls detektiert und die Information wird durch einen Computer gesammelt, der Chromatogramme erzeugt, die Peaks für jede Farbe zeigen, aus denen die Matrizen-DNA-Sequenz bestimmt werden kann.

Typischerweise ist das automatisierte Sequenzierungsverfahren nur für Sequenzen bis zu einer Länge von maximal etwa 700 bis 800 Basenpaaren genau. Es ist jedoch möglich, vollständige Sequenzen von größeren Genen und tatsächlich ganzen Genomen zu erhalten, indem schrittweise Verfahren wie Primer-Walking und Shotgun-Sequenzierung verwendet werden.

In

Primer Walking wird ein brauchbarer Teil eines größeren Gens unter Verwendung der Sanger-Methode sequenziert. Neue Primer werden aus einem zuverlässigen Segment der Sequenz erzeugt und verwendet, um den Teil des Gens, der außerhalb des Bereichs der ursprünglichen Reaktionen lag, weiter zu sequenzieren. Shotgun-Sequenzierung

beinhaltet zufälliges Schneiden des interessierenden DNA-Segments in geeignetere (handhabbare) Fragmente, Sequenzieren jedes Fragments und Anordnen der Stücke basierend auf überlappenden Sequenzen. Diese Technik wurde durch die Anwendung von Computersoftware zum Anordnen der überlappenden Stücke erleichtert.